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作者按
发育，衰老，再生。三个不同的生物学主题，但彼此的分子机理又遥相呼应。
在下面的故事中，具有发育生物学背景的王伟博士在寻找本领域博后遇挫后，尝试利用一种新型的鱼类衰老模型研究再生与发育在基因表达的差异再遭失败，最终却意外地找到了一系列全新的对再生过程特异性响应的基因调控序列——再生响应增强子；痴迷于揭示衰老机制的吕垣澄在博士研究的前四年屡战屡败，却意外地发现一组对逆转衰老寄予厚望的转录因子竟能激活神经元的再生。
在未来，我们能否真正理解衰老在基因表达上的本质特征？又能否找到安全有效的手段，真正做到逆转衰老？
谁道人生无再少？门前流水尚能西！休将白发唱黄鸡。
撰文｜黄宇翔
责编｜陈晓雪
第一节 另谋出路
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和几位心仪的教授谈完，王伟的心已经凉了半截。
王伟在博士期间研究影响果蝇体节发育性别差异的分子机制 [1,2]，对果蝇发育原理产生了浓厚的兴趣，因此借着这次参加果蝇发育大会的机会，打算向领域内几位研究果蝇发育进化机制的学术大牛毛遂自荐，主动寻求博后研究的工作岗位。
但一番谈话下来，王伟发现几位领域内的领军人物纷纷看衰果蝇发育进化领域未来的发展前景，认为目前基本的框架已经建立，不太会有特别重要的新发现了。
大牛们自己纷纷计划另谋出路，去寻觅新的研究领域，因此都不太可能在他们眼中已经“过气”的方向上继续招人。
2013年4月5日的晚上，会议安排了一个讨论再生研究的专场。从同行的报告中，王伟迅速意识到这是一个正飞速发展、充满机遇的新兴领域，重新打起了精神。
第二天，王伟为自己的研究设定了一个新的方向：再生。
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发育与再生，二者之间有着千丝万缕的联系。
生命体在发育过程中，一系列基因的选择表达决定了组织器官的形成，并在发育过程结束后及时关闭，处于休眠状态。那么，当组织器官发生损伤时，特定的刺激是否能够重新唤醒沉睡已久的基因再次表达，在受伤的器官上让发育的部分过程再次上演，进而实现对器官的修复？
检索近年来活跃在再生领域的研究团队，Sánchez Alvarado 这个重复出现的名字唤醒了王伟脑中一段久远的记忆：Sánchez Alvarado 曾在几年前某次发育生物学大会作过主题报告，介绍其利用涡虫研究器官再生原理的发现。更巧的是，王伟发现自己已经报名在6月的一门由海洋生物学实验实验室（MBL）举办的胚胎学培训课程，主管负责人正是美国斯托瓦尔斯研究所（Stowers Institute）对 Sánchez Alvarado 教授。
借着为期45天培训课程的机会，王伟向Sánchez Alvarado 教授充分展现了自己在遗传学和发育生物学方面扎实的训练——因此当在课程结束前的最后一天收到王伟的博后申请时，Sánchez Alvarado 很高兴地邀请他到自己位于堪萨斯的实验室参加面试。
面试非常顺利，Sánchez Alvarado非常希望王伟能加入自己的团队，但同时坦诚地告诉他目前实验室的涡虫小组人员已经接近饱和：“伟，你有没有兴趣去开拓一个新的模式动物的再生原理——非洲青鳉鱼？”
非洲青鳉鱼（African turquoise killifish）是一种生存于非洲干旱地区的野生小鱼，平均寿命只有四到六个月。斯坦福大学的Anne Brunet实验室饲养了一些在实验室，用于衰老的研究。
而Sánchez Alvarado之所以会对这种短命小鱼产生兴趣，则是源于再生领域内长期的一个不足：研究者使用各式各样的实验体系研究再生的分子机理，但彼此之间的结论却因为物种之间的巨大差异而难以整合在一起。
“脊椎动物中研究者最常用的模式动物是斑马鱼和小鼠，但考虑到斑马鱼和小鼠之间的差异，从一种实验动物中得出的结论很难在另一种生物中进行比较。” Sánchez Alvarado向王伟解释起再生领域内部研究者之间通力合作的一大阻碍，“但如果我们能直接比较斑马鱼和非洲青鲣鱼，那就很可能得到一些非常有意思的新发现了。”
生物学研究的本质是对照，而再生研究者最缺乏的恰恰就是一个合适的对照动物模型。
在再生研究领域建立一个新的鱼类模型，这对于领域会是个重大的推动，并且自己在研究生阶段确实也积累了不少建立新模型的经验。因此在思考了两周之后，王伟正式决定加入Sánchez Alvarado的团队。
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当时在全美范围内，能够在实验室中饲养繁殖非洲青鳉鱼的，仅有斯坦福大学Anne Brunet一家。
因此在到达堪萨斯后的第一个月，王伟就和实验室管理员飞到湾区向Anne Brunet实验室的成员学习养鱼技术，并要到了80个鱼卵带回斯托瓦尔斯研究所。
申请饲养一种新的实验动物，需要到动物中心办理许多手续，因此在非洲青鳉鱼的专属鱼房建成之前，王伟需要为这80个鱼卵找一个孵化场所。于是Sánchez Alvarado腾出了自己的一间办公室，专门供王伟在其中养鱼。
有了地方，鱼卵的孵化却出了大问题：尽管孵化条件处处都照搬Anne Brunet实验室传授的要诀，但鱼卵却纷纷孵化失败。80个鱼卵到头来只孵出了10只病怏怏的小鱼。
王伟一面祈祷这十只 “希望之鱼” 能尽快交配繁殖，一面想方设法调节鱼箱的条件让非洲青鳉们茁壮生长。
Anne Brunet实验室的养鱼之路也刚刚起步，鱼的状态也常常起伏，能分享的经验十分有限，因此王伟能依靠的只有自己。
在实验室中模拟出一种让野生生物兴旺生长的环境究竟有多艰辛，王伟的体会随着不断的失败日益加深。在接下来整整两年的时间里，他绝大多数时间都花在了每天给二三十缸鱼换水、摸索它们孵化、发育、繁殖的实验条件上。
终于在2015年底，他熟谙了非洲青鳉鱼的生长特性，已经能够稳定地培养出健康的鱼儿了。
其中的关键细节有两个。
第一是水温。王伟从Anne Brunet实验室学到最适宜非洲青鳉鱼生长的水温在26度左右，但培养了一段时间后王伟发现非洲青鳉鱼胚胎在这个水温下常常自动进入休眠，使得胚胎发育不同步、孵化率很低——如果把水温略微上调到28度，仅仅两度的细微差别，就能大大提升非洲青鳉鱼胚胎同步发育及孵化成功率。
其次是氧气浓度。为使鱼苗孵化后能将鱼鳔正常充气，Anne Brunet实验室会向孵化容器中额外添加一种在溶解后会释放氧气的“药片” 。但王伟发现，加了溶氧药片反而会让青鳉鱼苗长得更差——原来溶氧药片产生的过多氧气对于青鳉鱼苗而言毒性很大，而且通过药片释放氧气的速率很难得到精确的控制。后来，王伟给鱼缸安装了通气的循环系统，终于找到了一个为鱼群提供稳定氧气供给的方法。
终于建立好了养鱼系统，王伟迫不及待地开始了第一批的再生实验。
他和导师的预期是非洲青鳉鱼的再生能力会比较弱，因此如果从鱼鳍上切下一小段，不太会引发像斑马鱼那样强力的自我修复现象。
Anne Brunet实验室做的初步实验也表明，对于非洲青鳉鱼来说，断“鳍”确实难再续。
但在王伟从第一批成年的非洲青鳉鱼身上割下一截鱼鳍一周之后，新的鱼鳍竟然奇迹般地长了出来！
这是怎么回事呢？
短命的非洲青鳉鱼（来自王伟博士）
第二节
刮目相看
1
在实验室涡虫组的同事们都不太看好的情况下，王伟耗时两年，终于在实验室建成了非洲青鳉鱼的养殖系统。
出乎王伟和Sánchez Alvarado的意料，非洲青鳉鱼在被割去部分鱼鳍之后，只需要一周，竟然就能重新生长出全新的鱼鳍。
几次重复之后，王伟不仅确认了这一事实，并且找到了自己与Anne Brunet实验室不同实验结果的原因：Anne Brunet实验室的再生实验是切割年老青鳉鱼的尾鳍，不能观察到尾鳍再生；王伟切割的是年轻青鳉鱼的尾鳍，能引发尾鳍再生。这说明非洲青鳉鱼尾鳍的再生能力会随年龄增大而衰退。
实验现象与预期背道而驰，王伟立刻调整了思路，将自己的科学问题修改为：“在尾鳍再生的过程中，非洲青鳉鱼与斑马鱼中存在哪些共同的修复因子？”
借助RNAseq技术，王伟对于尾鳍切除手术前后的组织进行了转录组分析，希望能找出受伤以后哪些基因在两种鱼中都会发生上调，另外是否能利用非洲青鳉鱼找出一些在再生过程中发挥功能的新基因。
王伟于是挑选了200个受伤后转录表达升高的基因，通过CRISPR分组进行敲除，希望能在其中找到不影响其中发育、但对于再生必要的全新损伤修复因子。
时间很快来到了2016年的4月，王伟经过了一年多的筛选，还没有发现任何一个有希望的基因。王伟后来猜测认为，这轮筛选失败的原因可能是绝大多数的已知再生修复因子对于正常发育同样重要，因此在将它们敲除之后导致非洲青鳉鱼根本无法活到成年做尾鳍切割手术。
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就在筛选陷入停滞的时候，一篇新发表在《自然》的论文，为王伟带来了新的启发。
杜克大学Kenneth Poss团队发现，斑马鱼的尾鳍和心脏在发生再生时，一些被称作 “增强子” 的调控序列的活跃程度会显著升高。“增强子”是分布在基因组中的一些DNA片段，自身不会表达出有功能的蛋白质，但能通过激活其他基因的转录效率实现对基因表达的调控功能。
这一发现首次证明斑马鱼体内存在一些增强子，可以在再生修复过程中被激活，但所鉴定出的增强子在敲除后并不会显著破坏斑马鱼的器官再生能力 [3,4]。这意味着，再生修复的调节很复杂，只破坏其中一部分增强子，还有其他未知的调控元件维持斑马鱼必要的再生激活。
也许基因的选择性表达才是鱼类器官再生的关键？王伟忽然觉得自己此前专注于寻找再生特异基因的想法可能走错了方向。
在同事曾安和胡德庆的帮助下，王伟将实验方法改为用ChIP-seq技术去搜索斑马鱼和非洲青鳉在损伤刺激下活跃性增加的增强子片段。
到了2017年年底，王伟找到了在两种鱼类中进化保守的49个增强子片段——这些增强子的活性在鱼鳍再生的过程中处于高度活跃的状态。进一步的表达实验表明，这些增强子区域的确会在再生的过程中被激活。另外，王伟利用生物信息学分析找出了人源的IEN（inhba enhancer），将人源的IEN放在鱼中表达，也会对受伤的情况响应，也就是说王伟在功能上证明了人源IEN具有再生响应能力。
更为有趣的是，通过对筛选出的增强子序列进行分析，王伟发现上游激活这些增强子的很可能是同一个转录因子——AP-1，这是一个在各类细胞中都广泛存在的转录因子。
那么问题来了，这些增强子片段在功能上对于尾鳍的再生究竟是否必不可少呢？
敲除IEN片段，非洲青鳉鱼的尾鳍、心脏再生能力显著受损；在此基础上表达鱼源IEN能重新恢复非洲青鳉的再生能力，但是表达人源的IEN却不能恢复非洲青鳉的再生能力，说明人源的IEN在进化过程中发生了功能性变化。
这是历史上第一次找到具有功能的再生响应增强子！
更有趣的是，在比较两种生活环境差异很大的鱼类之后，王伟发现对再生必须的再生响应增强子是可进化的，并且鉴定出了保守的基因和调控元件，同时提出解释脊椎动物再生能力不均匀的理论模型。
2020年9月4日，这一发现发表于《科学》杂志 [5]。
2021年，王伟博士在北京生命科学研究所建立独立的实验室，进一步利用非洲青鳉这一模式生物深入探索再生在分子水平的秘密。
王伟博士，现北京生命科学研究所研究员
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相对于鱼类强力的器官再生能力，哺乳动物确实难以望其项背。
但器官再生的秘密，在演化的过程中是否被隐匿于关闭表达的基因网络之中？
调节基因的表达，是否能重新唤起哺乳动物体内沉睡已久的再生开关？
就在王伟准备将自己从青鳉鱼中获得的启示投稿出去的同时，在远隔千里的波士顿，一名研究生正为眼前显微镜画面中小鼠视网膜神经节细胞所呈现出的惊人画面兴奋不已。
第三节
休将白发唱黄鸡
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2018年6月28日，哈佛医学院共聚焦显微镜中心。
博士四年级的吕垣澄在低倍镜下找到了视网膜神经节细胞散发的模糊光斑，忐忑地将镜头切换到高倍镜。
当显微镜重新对准焦距之后，在显微镜连接的电脑屏幕上，一缕缕纤细的线条从轴突断裂的位点蔓延涌出，然后慢慢消失在前方的黑暗之中。
“本，你觉得这些信号是来自真正再生出的轴突吗？”吕垣澄激动地等待着身旁伙伴的反应。
“没错，轴突真的是重新长出来了。” Benedikt（Ben）Brommer凭借自己观察视神经节细胞轴突的丰富经验给出了肯定的答复。
吕垣澄立刻意识到，自己作出了一个真正的突破性发现。
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如果将时针回拨到半年以前，吕垣澄在 “逆转衰老” 课题上的摸索仍然显得遥遥无期。
他的导师是衰老领域的学术明星 David Sinclair，实验室的研究兴趣紧紧聚焦在 “衰老” 的话题上。
基于此前的研究，他们实验室提出了“表观遗传的变化是导致衰老的重要原因”这一假设，因此吕垣澄希望能找到一种重编程表观遗传修饰的疗法，逆转衰老造成的表观遗传变化，进而改善衰老相关疾病，甚至是延长个体的健康。
在研究生的前四年时间，他尝试了表达转录因子Nanog、化学小分子诱导等多种方式改变衰老小鼠细胞的表观遗传状态，但或是效果太差、或是毒性太强，都以失败告终。
因获诺奖而闻名的山中伸弥因子（Yamanaka factors），承载着他最后的一丝希望：2016年，Salk研究所的Juan Carlos Belmonte团队将Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc这四种能诱导细胞进入干细胞状态的转录因子同时表达在早衰模型的小鼠体细胞后，大幅延长了早衰小鼠的寿命 [6]。但上述这项研究也存在着明显的局限性：同时表达四种山中伸弥因子显著提高了小鼠罹患畸胎瘤的风险，另外该研究使用的都是转基因小鼠，因此无法向临床疾病拓展。
吕垣澄决定背水一战，在四种山中伸弥因子中剔除一个致癌基因c-Myc，将剩余的三种转录因子（ot4、Sox2、Klf4简称为OSK）整合进一个AAV（腺相关病毒）载体注入小鼠体内。
然而，尽管吕垣澄注射的AAV载体理论上应该能侵染到小鼠全身各类细胞，但他很快发现重组的OSK实际仅仅主要在肝脏细胞中表达。
而肝脏，在哺乳动物各个组织器官中恰恰又是衰老速度最为缓慢的。
研究的前路看上去被堵得死死的。
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吕垣澄重新理了理思路，究竟什么器官最先表现出衰老的症状？
器官衰老的普遍表现之一，就是其再生能力的下降。长期以来的研究表明，中枢神经系统的再生能力是最早丧失的，出生几天后神经系统的轴突就无法再生了。因此，中枢神经系统的损伤是最难以修复的，比如车祸或者中风导致的瘫痪，以及帕金森，阿尔兹海默等神经退行性疾病导致的行动能力下降，亦或是衰老或疾病导致的视力衰退。
而帮助吕垣澄制备表达OSK的AAV的何志刚教授实验室，恰巧专注研究能促进神经细胞在受到损伤后轴突再生的分子机制。
眼睛是中枢神经的延伸，不如直接试试把AAV打进眼睛里，看看表达OSK能不能促进视网膜神经元的轴突再生！吕垣澄把这个大胆的想法写进了一份哈佛医学院内部的基金申请，抱着试一试的态度交了上去。
很快，基金申请得到批准的好消息传来。经费到位，吕垣澄立刻与何志刚实验室展开了合作——何志刚实验室的资深技术员王晨帮助吕垣澄注射AAV和建立视神经损伤模型，博后Ben Brommer指导吕垣澄使用共聚焦显微镜测量视神经轴突的再生情况。
6月28日，到了观察结果的这一天，坐在冷冻切片机前的吕垣澄异常紧张，如果这个实验再不成功，前路又将陷入迷茫，博士毕业也将遥遥无期。
他深吸了几口气才让自己平静下来，然后屏住呼吸小心翼翼地进行切片。因为小鼠的视神经非常细，每一片切片的厚度只能有14µm，比我们最细的头发丝还要细。
随后，他和技术员余豆豆（处于本科毕业后的gap year ，目前已经申请到博士项目）与Ben一起将第一次收集到的诱导表达OSK后切断轴突的视神经切片拿到显微镜下观察。
坐在冷冻切片机前的吕垣澄举着第一个OSK诱导视神经再生的切片。本图由吕垣澄提供。
昏暗狭窄的显微镜室内，看到再生的视神经的瞬间，吕垣澄难以抑制住自己内心激动的心情，兴奋地叫出声来，与余豆豆和Ben击掌相庆。
接下来，吕垣澄的这一研究获得了一个个的新进展：
在视神经轴突被夹断后再表达OSK，仍然能诱导轴突的再生，显示出治疗（而不仅是预防）的前景——如果验证其能用于脊髓神经再生，对瘫痪的病人将是极好的消息；
在年老的小鼠中表达OSK，损伤后的轴突也能在被夹断后长出 “新枝”，表明其效果不受年龄的限制；
与麻省总医院专攻眼科疾病的 Meredith Ksander、Bruce Ksander 夫妇的合作，发现OSK表达能部分恢复青光眼疾病模型小鼠甚至是年老小鼠的视力，表明OSK表达不仅能恢复 “形态”，在功能水平同样对受损的视神经也有增益效果；
在安全性上，最早一批表达OSK的小鼠在生存两年之后并没有表现出比对照组更高的患癌风险。
更有趣的是，当他们去测量小鼠视神经细胞的表观遗传修饰，惊讶地发现轴突损伤会迅速增加视神经元的“表观遗传年龄”，而表达OSK能使 “表观遗传年龄” 的青春常在，恢复年轻的表观遗传修饰和基因转录水平——其中，DNA去甲基化酶TET1/2的作用必不可少，表明DNA的甲基化修饰是参与衰老和再生相关基因表达调控的一大重要修饰。
另外，实验室的同事田骁帮助吕垣澄对人类神经细胞进行了体外测试，发现OSK重编程同样能够诱导人类神经细胞轴突在损伤后的再生。
2019年7月31日，赶在妻子生产的前一天，吕垣澄将这些发现的相关数据和内容整理好，投稿《自然》并上传到预印本网站bioRxiv。之后经过一年多两轮的审稿和补充实验，这些发现最终在2020年12月3日作为封面文章发表于《自然》杂志 [7]。
哈佛大学已经将这一创新技术授权给波士顿的 Life Biosciences，期待将其用于人类衰老相关疾病，如青光眼病等的治疗。
吕垣澄也将再接再厉，与多个实验室合作，尝试在更多的器官中测试OSK疗法促进再生和逆转衰老的效果，并加入麻省理工的Jonathan Weissman 实验室做博后，探索表观遗传重编程的机理和更多途径。
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发育，衰老，再生。
三个不同的主题，但彼此的分子机理却又遥相呼应。
王伟的研究启发我们思考：当损伤发生时，机体是否能通过调动原本只在发育过程中激活的基因表达，让组织器官在 “二次发育” 的过程中实现再生？吕垣澄则通过他的OSK实验向我们揭示：再生能力之所以会随着机体的衰老而降低，本质上有可能是衰老引发了DNA甲基化修饰增加，阻碍了再生调控元件对细胞命运的重编程。
在未来，我们能否真正理解衰老在基因表达上的本质特征？又能否找到安全有效的手段，真正做到逆转衰老？
谁道人生无再少？门前流水尚能西！休将白发唱黄鸡。
2018年6月28日，吕垣澄在显微镜下观察到的图像：相比于对照组，OSK表达的视神经细胞在损伤后长出许多新的轴突 [7]。
参考资料：
[1]Wang, W., Kidd, B. J., Carroll, S. B. & Yoder, J. H. Sexually dimorphic regulation of the Wingless morphogen controls sex-specific segment number in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 11139-11144 (2011).
[2]Wang, W. & Yoder, J. H. Hox‐mediated regulation of doublesex sculpts sex‐specific abdomen morphology in Drosophila. Developmental dynamics 241, 1076-1090 (2012).
[3]Kang, J. et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature 532, 201-206 (2016).
[4]Thompson, J. D. et al. Identification and requirements of enhancers that direct gene expression during zebrafish fin regeneration. Development 147 (2020).
[5]Wang, W. et al. Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates. Science 369 (2020).
[6]Ocampo, A. et al. In vivo amelioration of age-associated hallmarks by partial reprogramming. Cell 167, 1719-1733. e1712 (2016).
[7]Lu, Y. et al. Reprogramming to recover youthful epigenetic information and restore vision. Nature 588, 124-129 (2020).
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