编者按

　　当同一种类的病毒导致的疫情再次出现时，人们难免疑惑：第二次疫情中的病毒究竟来自于哪里？它们是来自于无症状传播等自然过程，还是来自于样品泄漏等人为失误？科学家有方法找出病毒来源的蛛丝马迹吗？本文以蓝舌病毒为例介绍了寻找病毒来源的科学原理。

　　撰文 | 吴 蕾

　　责编 | 钱文峰 陈晓雪

　　蓝舌病毒（Bluetongue virus，BTV）是一种能引起蓝舌病（Bluetongue disease，BT）的RNA病毒，主要感染反刍动物，例如羊、牛、鹿等，其中以绵羊尤为易感 [1]。患病动物会出现高烧、流涎、面部和舌头肿胀等症状，少数动物的舌头会呈蓝色，这也是此病名称的由来。目前共发现了29个不同的BTV血清型 [2]，其中BTV-8在2006年于荷兰、比利时、德国、卢森堡等国发现。这一血清型的病毒随后在欧洲的十几个国家发生了大流行，造成了多达数十亿欧元的经济损失。2010年推行疫苗之后，疫情得到了有效的控制，随后的五年中再无BTV-8的报道。

　　但在2015年，法国再次出现了BTV-8，并引发了第二次大流行。[3]

　　欧洲地区2006-2018年报告的BTV-8病例[3]，数据来自世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health）。2009和2018年法国由于大流行而没有向OIE提供包含位置信息的病例数据，因此这两年的数据与其他年份不能进行比较

　　为什么时隔五年BTV-8会再次暴发？来自于法国国家食品、环境及劳动卫生署的 Sailleau 等人认为，此病毒在这五年间依然在牲畜和野生动物中保持小范围的持续传播，但并不表现出明显的症状（无症状感染动物），因此未被注意到 [4]。英国格拉斯哥大学的 David J. Pascall 等人则对这一假说进行了检验，发现很可能并非如此。相关文章在2020年4月28日发表于 PLOS Biology [3]。

01. BTV-8被 “冻结” 的进化

　　为了确定病毒之间的 “亲缘” 关系，Pascall 等人首先根据基因组序列构建了两次疫情中总计164个BTV-8病毒的进化树。

BTV-8的进化树[3]

　　紫色为来自第一次疫情的样品，橙色为来自第二次疫情的样品；横坐标展示每个样品与BTV-8祖先序列的遗传距离，距离越大则进化关系越远。

　　从该进化树中可以看出，第二次疫情中的样品构成了一个整体（单系群，monophyletic group），嵌在了第一次疫情的样品之中。这表明引发第二次疫情的病毒具有单一的共同祖先，而且这个祖先来自于第一次疫情。这并不足以对病毒来源于自然过程还是人为失误进行区分：尽管这种单一起源的方式似乎更符合人为失误导致少数病毒意外泄漏的猜测，但也有可能是因为无症状感染的动物恰恰携带了该祖先病毒。

　　这一进化树的不寻常之处在于，来自于两次疫情的样品（紫色和橙色）之间的枝长很短。进化树的枝长能够反映样品之间的序列差异程度。自然情况下，病毒每次复制的时候都不可避免产生一些新的突变，这种突变积累的速率基本保持恒定（即分子钟，详见《缺乏早期样品，还能追溯回病原体扩散的第一天吗？》），因此样品之间基因组的差异能代表它们的分化时间。以此论文分析的时间段来看，第一次疫情的时间段为2006-2010年，第二次疫情的时间段为2015-2018年，中间相隔了5年。在自然状态下，理论上两次疫情样本之间5年的差异，应该明显大于两次疫情各自的内部差异（3-4年）。然而在进化树中两次疫情之间的枝长（红色标出）短于每次疫情内部的枝长（紫色和橙色标出），这与理论推断并不一致，提示了第二次BTV-8疫情的非自然起源。

　　为了解第二次疫情的病毒起源于何时何地，Pascall 等人构建了第二次疫情中BTV-8的祖先序列，发现此序列与第一次疫情中2007年8月采集于法国的一个样品 BTV-8FRA2007-3673 的序列最为相似——而第二次疫情最早就是在法国暴发的。随后他们将这个祖先序列也纳入数据集，利用分子钟原理推断第二次疫情病毒祖先在第一次疫情中存在的时间。

BTV-8样品采集时间和其与祖先序列遗传距离的关系[3]

　　在上面的图中，横坐标表示样本采集的时间，纵坐标表示它们和两次疫情所有BTV-8的共同祖先的遗传距离。结果表明，第一次疫情（斜率为7.3×10-4个突变每个位点每年，r2=0.81）和第二次疫情（斜率为6.9×10-4个突变每个位点每年，r2=0.96）各自的时间段内，和祖先序列的差异与时间接近线性关系——符合生物进化的分子钟假设。尽管2010-2015年间没有BTV-8的报告，但是依然可以看出两次疫情之间存在间断，而且第二次疫情病毒的共同祖先在第一次疫情中对应的出现时间为2008年3月末。换言之，在每次疫情的时间段内，BTV-8的进化过程都符合自然状态；然而在2008年到2015年间，引发了第二次疫情的BTV-8的进化过程却仿佛被 “冻结” 了。

02. “冻结” 的进化与第二次疫情中BTV-8的来源

　　前面已经提到，自然界中的病毒在复制过程中会积累突变，时间越久积累的突变也就越多。然而第二次疫情中的BTV-8却经历了长达7年的进化停滞，并不符合自然状态下持续无症状传播的假说。那么是什么导致了病毒的进化过程被 “冻结” 呢？

　　BTV不是反转录的RNA病毒（例如艾滋病毒），因此不太可能在宿主体内沉默数年而不复制；另外，BTV的传播需要昆虫宿主，并且无法在昆虫中长期潜伏。排除了以上两种可能后，Pascall 等人猜想2015年出现的第二次疫情可能是由于受到了BTV-8污染的冷冻材料被重新释放到了自然环境。首当其冲的假设是实验室泄漏——然而他们认为这也不成立，因为根据目前了解到的情况，在2010-2015年间法国并没有实验室使用昆虫宿主开展BTV的体内研究。

　　值得注意的是，家畜饲养过程中存在一个独特的暴露于冷冻病毒的风险——人工授精和胚胎移植技术，这一技术尤其被广泛应用于奶牛的繁育。已有研究表明，公牛的精液中可以检测出BTV。这些病毒能够感染母体，传递给胚胎 [5， 6] 并且在胚胎移植过程中传播 [7]。虽然出口的公牛精液按规定必须进行包括BTV在内的各种病原体筛查，但这些法规并不适用于提供人工授精服务的本地公司。因此，作者推测，受到BTV-8污染的公牛冷冻精液或胚胎是BTV-8第二次疫情最可能的来源。不过，这只是排除了诸多其他可能性之后作者推测的最可能发生的情形。尽管数据支持BTV-8的进化历程受到了 “冻结”，究竟来源于哪种类型的人为失误还有待进一步的实证研究。

03. 结 语

　　如何判断二次暴发的病毒是来自于无症状传播等自然过程，还是来自于样品泄漏等人为失误？在BTV-8二次暴发的案例中，作者判断来自于人为失误。理由有二：首先是能够在已有的数据库中找到与之高度相似的序列；其次，冷冻大幅减缓了这些病毒的进化。

　　历史上，通过分析暴发的病毒序列找到其来源的案例并不少见。1977年，在前苏联和我国东北暴发的H1N1流感病毒与1950年流行株系的序列几乎一致，不符合自然起源的规律，可能是由使用不合格的疫苗导致的[8]。2007年8月流行于英国的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）与研究机构的意外泄漏有关：通过基因组序列分析，Cottam等人发现这次疫情中的口蹄疫病毒来自于“FMDV O1 BFS 1860”，该株系由位于英国 Pirbright 研究所的两个口蹄疫实验室保藏[9]。

　　这一方面警示我们需要进一步加强相关领域的管理水平，同时表明如果真的发生了人为失误导致病毒的二次暴发，科学家有办法有效地追踪其来源。

　　作者简介

　　作者吴蕾为中国科学院大学研究生。

　　参考文献

　　1.Han， Y.， et al.， Single-cell transcriptome analysis reveals widespread monoallelic gene expression in individual rice mesophyll cells. Science Bulletin， 2017. 62（19）： p. 1304-1314.

　　2.Huan， Q.， et al.， HeteroMeth： A Database of Cell-to-cell Heterogeneity in DNA Methylation. Genomics Proteomics Bioinformatics， 2018. 16（4）： p. 234-243.

　　3.Pascall， D.J.， et al.， "Frozen evolution" of an RNA virus suggests accidental release as a potential cause of arbovirus re-emergence. PLoS Biol， 2020. 18（4）： p. e3000673.

　　4.Sailleau， C.， et al.， Re-Emergence of Bluetongue Virus Serotype 8 in France， 2015. Transbound Emerg Dis， 2017. 64（3）： p. 998-1000.

　　5.Thomas， F.， E. Singh， and W. Hare， Control of bluetongue virus spread by embryo transfer. Progress in clinical and biological research， 1985. 178： p. 653.

　　6.Backx， A.， et al.， Clinical signs of bluetongue virus serotype 8 infection in sheep and goats. The Veterinary Record， 2007. 161（17）： p. 591.

　　7.Haegeman， A.， et al.， Failure to remove bluetongue serotype 8 virus （BTV-8） from in vitro produced and in vivo derived bovine embryos and subsequent transmission of BTV-8 to recipient cows after embryo transfer. Frontiers in Veterinary Science， 2019. 6： p. 432.

　　8.Rozo， M. and G.K. Gronvall， The Reemergent 1977 H1N1 Strain and the Gain-of-Function Debate. mBio， 2015. 6（4）.

　　9.Cottam， E.M.， et al.， Transmission pathways of foot-and-mouth disease virus in the United Kingdom in 2007. PLoS Pathog， 2008. 4（4）： p. e1000050.