CRISPR-Cas系统是当前基因编辑领域应用最为广泛的生物技术| 图源：pixabay.com

 

撰文｜计永胜

 

编辑｜陈晓雪

 

CRISPR-Cas系统是当前基因编辑领域应用最为广泛的生物技术。2020年诺贝尔化学奖授予德国马克斯普朗克研究所教授Emmanuelle Charpentier和美国加州大学伯克利分校教授Jennifer A. Doudna，以表彰她们在基因编辑（CRISPR/Cas9）领域做出的开创性工作。

 

现有的CRISPR-Cas系统可以分为两类，主要区分点就是Cas蛋白的不同。因为较高的编辑效率，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是现在最常用的基因编辑工具。

CRISPR-Cas系统分类 | 图源[1]

 

CRISPR-Cas基因编辑系统的主要原理是通过一个叫向导RNA（guide-RNA，gRNA）的核酸片段在宿主基因组找到要进行基因编辑的位置，也就是靶向DNA序列，然后通过Cas蛋白对DNA进行切割。在实际操作中，我们会把编码Cas蛋白的核酸片段连接到一种递送载体（例如质粒、腺相关病毒等），通过载体 “运” 进细胞，然后再一步步表达成最终发挥效应的Cas蛋白。

CRISPR-Cas基因编辑系统原理 | 图源[2]

 

CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的编辑效率高，但也存在局限。构成Cas9和Cas12a蛋白的氨基酸数量均超过1000，也就是说编码这两种效应蛋白的核苷酸（对）数量均大于3000。把这么多的核苷酸有效包装进一些递送系统显得有些困难。例如，腺相关病毒递送系统的最大承载量是4700个核苷酸，比编码酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9的基因（4200个核苷酸）长不了多少 [3]，根本没有空间组装其他调控元件。

 

正因此，寻找 “体格” 比较小，但仍能发挥 “剪刀” 功能的Cas效应蛋白是很多课题组的研究方向。

 

Jennifer A. Doudna团队先后发现两种小型的、可以对人类细胞基因组进行编辑的Cas效应蛋白：CasX（Cas12e，986个氨基酸）和CasF（Cas12j，700~800个氨基酸）[4, 5]。

 

在此之前，该课题组还发现一种更小的名为Cas14a1【从非培养古细菌（Uncultured archaeon）获得，因此又名Un1Cas12f1，400~700个氨基酸】的效应蛋白可以切割单链DNA [6]。来自立陶宛维尔纽斯大学（Vilnius University）生物技术研究所的 Virginijus Siksnys 团队则进一步证实Cas12f还具有切割双链DNA的能力 [7]。

Cas12f与Cas9、Cas12a的大小比较 | 图源[7]

 

可以说，Cas12f是迄今鉴定出的最小的具有基因编辑潜力的Cas蛋白。

 

那么，从其他细菌获得的Cas12f是否具有基因编辑的能力呢？Un1Cas12f1能否编辑哺乳动物细胞的基因组呢？换句话说，这些 “迷你”Cas蛋白是否能应用于基因编辑？

 

2021年9月2日，上海科技大学物质科学与技术学院教授季泉江团队在《自然·化学生物学》（Nature Chemical biology）发表文章，系统阐述了该团队对Cas12f1功能的研究 [8]。

因为研究所用的编码Cas12f1的基因从一种名为Acidibacillus sulfuroxidans 的嗜热细菌中获得，该团队将其命名为AsCas12f1，其长度只有422个氨基酸。研究人员首先通过一系列生化实验证明AsCas12f1在向导RNA的指引下进行双链DNA的切割。进一步的，该团队确定CRISPR -AsCas12f1可以对大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的基因组进行编辑，编辑效率与经典Cas9不相上下，最高可以达到100%。

 

而在人类细胞（HEK293细胞，一种模式细胞）进行基因编辑检测后，该团队发现CRISPR-AsCas12f1的编辑效率最高在30%左右，低于Cas9、Cas12a等。但令人欣喜的是，AsCas12f1可以通过包括质粒和腺相关病毒在内的多种递送系统发挥功能。

CRISPR -AsCas12f1对细菌基因组进行高效编辑 | 图源[9]

 

“不论是AsCas12f1自身，还是改造出的一些衍生基因编辑工具，我觉得都可以应用在疾病治疗方面，比如说遗传性疾病，感染性疾病的治疗。另一个就是可以改造成核酸检测的工具。” 论文通讯作者季泉江接受《知识分子》采访时表示。

 

针对目前AsCas12f1在人类细胞中编辑效率不如Cas9的问题，季泉江表示，他们准备通过分子进化的方法进行改进。与此同时，也会基于蛋白质的结构对其进行理性设计，或者利用随机突变找到功能更好的蛋白。

 

“比如我们的蛋白结合核酸的能力相比Cas9较弱，那就可以针对这一问题做些改造，把跟核酸结合区域的这些氨基酸突变成带正电的氨基酸，这样就可以与带负电的核酸有更强的结合能力；再比如可以通过引入一些额外的相互作用，改变它对PAM的识别，拓展识别范围。”季泉江说。

 

9月3日，另外一个团队则报告了对于优化了的Un1Cas12f1的研究。

 

来自韩国科学技术大学 Yong-Sam Kim 和同事通过对CRISPR-Cas12f1系统的原始向导RNA进行了5个位点的优化，提升了Un1Cas12f1的编辑效率。并且，经过优化的CRISPR-Cas12f1可以通过质粒和腺相关病毒等途径进入人类细胞，进行基因编辑 [9]。

 

简单地讲，不管是Un1Cas12f1还是AsCas12f1，这些个头只有Cas9和Cas12a一半的效应蛋白，同样具有在哺乳动物细胞进行基因编辑的能力，并且和腺相关病毒载体这种临床研究中常用的器官靶向基因治疗递送系统很 “般配”。效应蛋白小，就能给递送系统腾出更多空间安装其他调控原件，提升基因治疗的效率，未来也将具有更广阔的的应用前景。

参考资料

 

[1] Makarova, K. S. et al. Evolutionary classifcation of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 18, 67–83 (2020).

 

[2] Wang, H., La Russa, M. & Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annu. Rev. Biochem. 85, 227–264 (2016).

 

[3] Doudna, J.A. (2020). The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature 578, 229–236.

 

[4] Liu, J. J. et al. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature 566, 218–223 (2019).

 

[5] Pausch, P. et al. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333–337 (2020).

 

[6] Harrington, L. B. et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science 362, 839–842 (2018).

 

[7] Karvelis T, Bigelyte G, Young JK, et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res. 2020 May 21;48(9):5016-5023. doi: 10.1093/nar/gkaa208. PMID: 32246713; PMCID: PMC7229846.

 

[8] Zhaowei Wu, Yifei Zhang, Haopeng Yu  et al., Programmed genome editing by a miniature

 

CRISPR-Cas12f nuclease. Nature Chemical biology. 2021

 

[9] Do Yon Kim, Jeong Mi Lee , Su Bin Moon et al., Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nature biotechnology (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01009-z